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從17世紀開始，現代生物學的發展就與顯微成像技術緊密相關。然而，由于受光學衍射極限的影響，傳統光學顯微成像分辨率小約為入射光波長的一半。因此，科學家們一直在不斷努力，試圖尋找突破光學顯微鏡分辨極限的方法。
在超分辨顯微技術飛速發展的同時，現有成像技術的缺陷也日益顯現，例如成像分辨率和成像時間不可兼得;對透鏡制造技術提出了一定要求的同時，也限制了觀測的視野;日益復雜的設備使得操作和維護也越來越困難……為了解決上述問題,需要發展一些新型的超分辨技術以適應不同領域的要求。
表面增強超分辨技術
現有超分辨技術在樣品縱向圖像的獲取上可分為兩類：
1. 通過增加可獲取的信號縱深以更好地獲取樣品的三維圖像，如雙光子熒光顯微技術等;
2.通過降低可獲取的信號縱深以更好地獲取樣品表面的圖像，如等離子結構照明顯微技術(PSIM)和基于芯片的寬視場納米顯微術(CWN)等。
下面主要介紹第2類技術中的兩種新型前沿顯微技術，二者都是利用特殊材料的樣品作為載物臺對照明光進行有效的調制，以增強樣品表面的成像效果。
等離子結構照明顯微技術
PSIM是于2014年由WeiFF等在傳統結構光照明顯微(SIM)原理的基礎上利用表面等離子體干涉(SPI)代替光學干涉，從而獲得達到SIM兩倍分辨率的新型超分辨顯微技術，該技術的關鍵在于對表面增強拉曼散射(SERS)的應用。
近年來，SIM由于其光毒性低、成像速度快、適用于觀察活細胞等優點得到了越來越廣泛的應用，然而傳統SIM由于原理上的限制只能達到衍射極限兩倍左右的成像分辨率。PSIM將SIM與可調制的SPI結合起來，用SPI序列作為新的照明光源代替傳統SIM中的激光干涉條紋，利用振鏡掃描實現條紋變化，通過重建達到了相當于傳統SIM兩倍的分辨率。
圖1 PSIM技術下的直徑為100 nm的熒光顆粒。(a)傳統的熒光顯微;(b)重建的PSIM圖像;(c)對應的SEM圖像;(d-e)a，b兩圖的傅里葉變換，黃色虛線代表光學傳遞函數。(f)藍色的為傳統熒光成像的截面強度分布，綠色和紅色為PSIM重建后的兩個軸向分布
相比之下，PSIM主要有以下優點：
1.高分辨率。與傳統SIM技術和SSIM技術相比，PSIM的優勢在于在不減幀速且不利用飽和熒光效應的前提下獲得高分辨率的顯微圖像。
2.高信噪比。倏逝波在垂直方向上快速衰減,通過將激發光限制在樣品表面一個很小的區域內即可得到較高的信噪比。
3.成像分辨率不依賴于NA。PSIM原理上不依賴于NA的限制,利用較小NA的物鏡仍可獲得比SIM更高分辨率的圖像。
4.極大的應用前景。對于諸如哺乳動物細胞等需要對其表面進行觀測的樣品，PSIM是一種能夠較好地解決衍射極限問題、同時還具備較高對比度的成像手段。這種技術將在高速超分辨領域內產生巨大的影響。
芯片照明超分辨
基于芯片的CWN，簡稱芯片照明超分辨，利用照明光在波導片與樣品界面處產生的瞬逝場使得樣品僅在表面極薄的部分得到激發，從而減弱獲取信號中背景信息的干擾，實現超分辨。
CWN技術是由Grandin等在2006年提出的，并由Diekmann等在2017年進行改進。Diekmann等利用波導片實現了照明光與探測光的*分離，在原有的平板波導的基礎上研制了可控能力更強的肋形波導和帶狀波導，如圖2所示,將復雜的光學功能集成在以波導片為主體的通用平臺上。
圖2 波導片a.在原有平板波導的基礎上部分蝕刻可制成肋形波導;b.在原有平板波導的基礎上*蝕刻至SiO2底板可制成帶狀波導。兩種情形下波導通道的寬度都是25-500 μm
CWN的主要優點有：
1.波導片的應用將激發光路*從顯微系統中分離出去，使用時無需考慮光路的耦合，大大降低了整套設備的復雜度;
2.波導片利用光在高折射率材料和周圍介質(水或細胞)間的界面上發生全內反射的原理，地利用瞬逝場照明樣品;
3.由于其對照明光在空間上的嚴格限制，圖像具有較高的信噪比;
4.由于照明光與成像光的物鏡非相關，因此可以隨意根據需要更換不同放大倍數/分辨率的物鏡;
5.由于該技術對光信號的利用效率高，使用NA較小的物鏡即可在獲得較大視場的同時，確保圖像的分辨率不至于太差。
Diekmann等利用兩種互補的技術———ESI技術和直接STORM(dSTORM)技術，展現了基于波導芯片的超分辨熒光顯微成像技術的功能。這項技術解決了一直以來存在于超分辨顯微技術中的缺陷,提高了超分辨顯微系統的應用性能，有極大的市場價值和開發前景。此外，該技術為研究者提供了新的思路，基于芯片的激光產生、過濾和調制技術將為超分辨顯微領域帶來發展的新動力。可以預見，未來的超分辨顯微領域將會因為光子集成電路的發展而再次產生較大的飛躍。
偏振超分辨成像技術
熒光的基本物理尺寸包括強度(反映熒光濃度)、波長(吸收和發射光譜)、時間(熒光衰減壽命)和偏振(由偶極子取向產生)。想比于其他三個維度，偏振在超分辨領域的發展仍處于初級階段。
2014年，Walla課題組提出了偏振調制超分辨(SPoD)技術。該技術在不需要結構光照明、開關調制以及閃爍熒光探針的條件下通過偏振調制以及偏振角度縮小實現了超分辨成像，將偏振引入超分辨顯微成像領域。偏振調制數據采用SPEED反卷積算法進行解調，從而重構超分辨圖像。該方法雖然可以實現超分辨，但重構期間會導致偶極子方向信息丟失。
2016年10月31日，北京大學課題組及其合作者提出了一種新的基于偏振偶極子方位角的SDOM技術。該技術利用稀疏增強反卷積算法代替了SPEED算法，同時從熒光強度和熒光各向異性等方面來考慮偏振調制能否帶來更多超分辨信息，回答了上述爭論問題，并在實現相同強度分辨率的條件下進一步獲取了偶極子取向信息。
另一種偏振超分辨技術主要基于單分子成像。Cruz等提出的偏振解析dSTORM(polar-dSTORM)可在一幀中測量單個熒光偶極子，并通過隨機切換開/關狀態在其他幀中測量其他的偶極子取向，再通過重建獲得整體的超分辨率圖像。在polar-dSTORM中，為了保持單分子定位中的高信噪比，使用兩個探測通道來實現平面取向內偶極子取向信息的測量，并忽略單個偶極子的擺動信息。通過重建算法計算每幀中單個分子的方位角和位置，可以實現單分子的準確定位和取向測量。
相比于其他超分辨技術，利用偏振實現超分辨的優勢在于：在不犧牲成像速度和樣品毒性的前提下獲取樣品的超分辨信息;可在不影響原系統性能的條件下很容易與現有的成像系統相結合使用。因此，未來熒光偏振超分辨顯微鏡可在更多的生物領域中發揮作用。
還有一種不依賴于光學技術來突破衍射極限的方法，該方法是在衍射極限存在的條件下人為地放大生物樣品，從而觀察到更細微的結構信息。這便是我們接下來要講述的利用化學方法將樣品物理放大的膨脹樣品超分辨成像技術。
膨脹樣品超分辨成像技術
膨脹樣品顯微術(ExM)的概念是由Chen等于2015年提出的，該技術利用高吸水性分子吸水溶脹的特性，將樣品物理放大以達到超分辨顯微的效果。這種高吸水性分子常見的用途之一就是嬰兒尿布。我們知道在吹氣球的時候，氣球吹得越大，氣球的厚度越薄，也就是說，我們想要讓樣本放得更大，就需要減少細胞中那個由高吸水性分子形成的網的密度，如此一來大的問題便是細胞在溶脹過程中無法各向同性的擴大，會導致細胞結構變得極其不穩定，也就沒有了觀察的意義。
如何將一個樣品在高度放大的同時保留其原有結構呢?
研究人員通過努力找到一種方法使得細胞在溶脹的過程中還可以保持其結構的穩定，而這種方法便是采用另一種高吸水性分子凝膠。在樣本隨著吸水分子的膨脹倍增之后，讓凝膠去破壞原有吸水分子間的交聯以保持樣品結構的穩定，隨后再次讓樣本膨脹，進一步放大它的尺寸。如此一來，樣本可放大到20倍左右，分辨率達到25 nm。
ExM便宜、快速且分辨率高，在超分辨顯微成像中已是一個巨大的突破，可實現常規超分辨光學顯微鏡可達到的效果。相比于傳統顯微鏡，ExM的時間分辨率無附加限制，但空間分辨率可以達到25 nm。相比于原有超分辨技術，其樣品制備要求與傳統顯微鏡相同,因而適用范圍較廣。
表 幾種新型成像方法對比
上述幾種新型的超分辨技術在不同的應用中各有所長，為光學成像領域帶來了新的曙光。隨著人們對生命科學領域的不斷深入探索，超分辨技術將會繼續發展以滿足不同的應用需求。
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